توالی یابی DNA یا (DNA Sequencing) فرآیندی است که در آن توالی نوکلئوتیدهای موجود در یک مولکول DNA تعیین می‌شود. DNA هر ارگانیسم از یک توالی منحصر به فرد از نوکلئوتیدها تشکیل شده است. تعیین توالی DNA قادر است به دانشمندان در مقایسه DNA بین ارگانیسم‌های مختلف کمک کند که این کار می‌تواند در شناخت ارتباطات بین ارگانیسم‌ها و روابط فیلوژنتیکی آن‌ها موثر باشد.

بررسی اجمالی توالی یابی DNA
توالی یابی DNA بدان معنی است که با تعیین توالی یک قطعه از DNA، می‌توان از ترتیب قرارگیری چهار باز نوکلئوتیدی آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین در آن مولکول اطلاع پیدا کرد. ضرورت توالی یابی DNA برای اولین بار توسط نظریه «فرانسیس کریک» (Francis Crick) تعیین شد که براساس این نظریه مشخص شد توالی نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA مستقیماً بر توالی اسیدهای آمینه پروتئین‌ها تأثیر می‌گذارد. در آن زمان اعتقاد بر این بود كه توالی یابی کامل ژنوم، منجر به جهش بزرگی در فهم بیوشیمیایی سلول‌ها و ارگانیسم‌ها می‌شود.
در تعیین توالی DNA مدرن، از «روش‌های پرتوان» (High Throughput Methods) استفاده می‌شود که که این امکان را فراهم کرده‌اند که توالی‌های DNA در طی چند ساعت مورد شناسایی قرار بگیرند. این فناوری برای بسیاری از شرکت‌ها این امکان را به وجود آورده است تا بتوانند روش‌هایی برای آزمایش‌های خانگی DNA را به مشتریان خود ارائه دهند. بسیاری از نتایج حاصل از این آزمایش‌ها، صرفاً ارتباطی است که بین یک واریانت ژنتیکی و یک بیماری خاص وجود دارد. با این حال، این فناوری همچنین به دانشمندان اجازه داده است كه DNA بسیاری از ارگانیسم‌ها را مورد بررسی قرار دهند تا روابط تكوینی و فیلوژنتیکی بین آن‌ها را بهتر شناسایی کنند.


تصویر ۱: دستگاه‌های خانگی توالی یابی DNA که در قالب یک USB ساخته شده‌اند که پس از دریافت نمونه برای بررسی و تحلیل داده‌ها به کامپیوتر وصل می‌شوند. در این دستگاه از تکنولوژی نانو حفره استفاده شده است.

نمونه‌ای از توالی یابی DNA
اگرچه تعیین توالی DNA در گذشته و در سال‌های ابتدایی ابداع این فناوری به زمان بسیاری نیاز داشت و گاهی تا چندین سال به طول می‌انجامید، اما اکنون با رشد تکنولوژی تعیین توالی DNA را می‌توان طی چند ساعت انجام داد. علاوه بر این، اولین پروژه «تعیین توالی کامل DNA انسانی» (Human Whole Genome Sequencing) حدود 3 میلیارد دلار هزینه در بر داشت، در حالی که اکنون، شرکت‌های معتبر در این زمینه کل ژنوم انسان را با قیمت کمتر از 1000 دلار تعیین توالی می‌کنند و با پیشرفته‌ترین آزمایش‌ها، نوکلئوتیدهای موجود در ژنوم انسان را مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌دهند. شرکت‌های بیوتکنولوژی و ژنتیکی معتبر در سراسر جهان علاوه بر توالی یابی DNA خدماتی مانند آزمایش‌های «پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی» (Single Nucleotide Polymorphism) برای شناسایی تغییرات و جهش‌های ژنتیکی در ژنوم فرد را نیز ارائه می‌دهند.



این آزمایش‌ها بر نوکلئوتیدهای منفرد در ژن‌هایی تمرکز دارند که می‌توانند واریانت ژنتیکی خاصی را نشان دهند. در واقع پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی، همان طور که در تحقیقات بالینی مشخص شده است، با شرایط خاصی ارتباط دارند و می‌توانند در پیش‌بینی چگونگی تأثیر ژن‌های بدن بر زندگی فرد کمک کنند. برخی از توالی‌هایSNP ‌با بیماری‌های مختلف ارتباط دارد، در حالی که برخی دیگر مربوط به متابولیسم بدن و چگونگی پردازش مواد مغذی در آن است. در مورد پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی هزاران رابطه مختلف یافت شده و می‌توان از تعیین توالی DNA برای تشخیص اینکه ژنوم انسان چه تاثیری بر زندگی آن دارد، استفاده کرد.

روش‌های توالی یابی DNA
توالی یابی DNA به دو روش اصلی در سراسر جهان انجام می‌گیرد. روش قدیمی آن به عنوان روش خاتمه زنجیره‌ای یا «روش سنگر» (Sanger Method) شناخته می‌شود. روش‌های جدیدتر که می‌توانند تعداد زیادی از مولکول‌های DNA را به سرعت پردازش کنند، در مجموع به عنوان روش «توالی ‌یابی با بازدهی بالا» (High Throughput Sequencing) یا روش‌های توالی یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing) یا (NGS) معروف هستند.

توالی‌ یابی به روش سنگر
روش «سنگر» (Sanger) به یک آغازگر متکی است که به مولکول DNA دناتوره شده (تک رشته‌ای) متصل می‌شود و سنتز یک مولکول پلی نوکلئوتیدی تک رشته‌ای را در حضور یک آنزیم DNA پلیمراز، (با استفاده از DNA دناتوره شده به عنوان رشته الگو) آغاز می‌کند. در بیشتر شرایط، آنزیم با اضافه کردن نوکلئوتیدها به رشته آغازگر، واکنش را کاتالیز می‌کند. بنابراین پیوند کووالانسی بین اتم کربن ’3 مولکول قند دئوکسی ریبوز در یک نوکلئوتید و اتم کربن ’5 نوکلئوتید بعدی تشکیل می‌شود. در تصویر زیر نحوه شکل‌گیری این پیوند نشان داده شده است.


در یک مخلوط واکنش توالی یابی، ممکن است یک بخش کوچکی از نوکلئوتیدهای تغییر یافته که به دلیل فقدان گروه واکنشگر هیدروکسیل، نمی‌توانند پیوند کووالانسی تشکیل دهند، واکنش تکثیر را متوقف کنند و دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدها را ایجاد نکنند. در واقع این نوکلئوتیدها اتم اکسیژن ’2 یا ’3 را در مقایسه با سایر ریبونوکلئوتیدها ندارند. با این کار واکنش پلیمریزاسیون DNA به موقع خاتمه می‌یابد. در پایان چند دور از چنین پلیمریزاسیون‌هایی، مخلوطی از مولکول‌‌ها با طول‌‌های مختلف ایجاد می‌شود.
در اولین تلاش برای استفاده از روش سنگر، ابتدا مولکول DNA با استفاده از یک آغازگر دارای برچسب تقویت شده و سپس به چهار لوله آزمایش تقسیم می‌شود که هر کدام تنها یک نوع ddNTP دارند. یعنی هر مخلوط واکنش فقط یک نوع نوکلئوتید تغییر یافته دارد که می‌تواند باعث خاتمه زنجیره شود. پس از اتمام چهار واکنش، مخلوط مولکول‌های DNA ایجاد شده توسط روش خاتمه زنجیره یا سنگر، تحت الکتروفورز با «ژل پلی آکریل آمید» (Polyacrylamide Gel) قرار گرفته و با توجه به طول هر قطعه از یکدیگر جدا می‌شوند. در تصویر ۴، یک واکنش توالی با ddATP از طریق ستون دوم الکتروفورز می‌شود. هر خط یک مولکول DNA از یک طول خاص را نشان می‌دهد که در نتیجه یک واکنش پلیمریزاسیون است که با اضافه کردن یک نوکلئوتید ddATP خاتمه یافته است. ستون‌های اول، سوم و چهارم به ترتیب شامل ddCTP ،ddGTP ،ddTTP بودند. با گذشت زمان، این روش به گونه‌ای مورد تغییرات قرار گرفت که در آن هر ddNTP دارای یک برچسب فلورسنت متفاوت بود. در این شرایط آغازگر دیگر منبع برچسب رادیواکتیو یا فلورسنت نبود. روش سنگر در این حالت به عنوان روش توالی یابی رنگ پایان دهنده شناخته می‌شود، این روش توالی یابی از چهار رنگ با طیف انتشاری بدون همپوشانی برای هر یک از ddNTP استفاده می‌کند.


تصویر : روش‌‌های تعیین توالی و برچسب زدن DNA؛ این تصویر تفاوت بین آغازگر‌های دارای برچسب، dNTP‌‌های دارای برچسب و NTP‌‌های رنگ شده خاتمه دهنده را نشان می‌دهد.
تصویر زیر نمایش شماتیک از روش توالی یابی رنگ خاتمه دهنده را نشان می‌دهد. یک مخلوط واکنش منفرد وجود دارد که تمام عناصر مورد نیاز برای طویل سازی مولکول DNA را در بر دارد. مخلوط واکنش همچنین حاوی غلظت‌‌های کمی ‌از چهار ddNTPs است که هر یک برچسب فلورسنت متفاوتی دارند. پس از اتمام واکنش توالی یابی، محصول واکنش بر روی ژل کپیلاری یا مویینی مورد الکتروفورز قرار می‌گیرد. نتایج از طریق آنالیز طیف انتشار از هر باند DNA روی ژل بدست می‌آید. سپس یک برنامه نرم افزاری طیف‌‌ها را تجزیه و تحلیل می‌کند و توالی مولکول DNA را ارائه می‌دهد.


تصویر ۴: روش توالی یابی سنگر؛ در این تصویر در مخلوط واکنش، علاوه بر ddNTPها از آنزیم DNA پلیمراز، رشته آغازگر و رشته الگو استفاده می‌شود.

توالی یابی به روش ماکسام-گیلبرت
در سال ۱۹۸۰ همزمان با معرفی روش توالی یابی سنگر، روش توالی یابی ماکسام و گیلبرت (Maxam-Gilbert Sequencing) که به روش توالی یابی شیمیایی نیز معروف بود، در دنیای ژنتیک شناخته شد. در ابتدا روش ماکسام و گیلبرت از استقبال بهتری نسبت به روش سنگر برخوردار شدند، زیرا در روش ماکسام و گیلبرت، محققان می‌توانستند از DNA تخلیص شده به صورت مستقیم استفاده کنند، در حالی که در روش سنگر برای شروع کار نیاز به کلونینگ ژن است. اما بعدها تکنیک ماکسام- گیلبرت به فراموشی سپرده شد. روش ماکسام-گیلبرت شامل چهار مرحله است: • در مرحله اول برای آماده سازی نمونه مولکول DNA را به صورت تک رشته دناتوره می‌کنند و پس از آن در انتهای ’۵ آن برچسب گذاری انجام می‌دهند که در این روش اغلب از فسفر ۳۲ استفاده می‌شود. • در مرحله دوم DNA توسط پیپریدین (Piperidine) و دو ترکیب شیمیایی دیگر که به پورین‌ها و پیریمیدین‌های مولکول DNA حمله می‌کنند، شکسته می‌شود. هر کدام از ترکیبات شیمیایی، مولکول DNA را در محل یکی از ۴ باز آدنین، تیمین، گوانین و سیتوزین برش می‌دهند، با قرار دادن ۴ لوله آزمایش برای هر ترکیب شیمیایی، می‌توان ۴ نمونه از قطعات با برش‌های یکسان را به دست آورد. • بعد از دستیابی به قطعات برش خورده DNA نمونه، هر کدام از آن بر روی ژل پلی آکریلامید با درصد بالا مورد الکتروفورز قرار می‌گیرند. برای تمایز بین قطعات مختلف از برچسب‌های رادیواکتیو استفاده می‌شود. • برای خوانش توالی DNA نمونه، باید از کوچکترین قطعه در پایین ژل شروع کرد.

توالی یابی توان بالا
توالی یابی به روش سنگر همچنان برای تعیین توالی‌‌های مولکول‌های نسبتاً طولانی DNA به ویژه در حجم کم مفید است. با این حال، وقتی تعداد زیادی از مولکول‌‌ها به سرعت نیاز به توالی یابی داشته باشند، استفاده از روش سنگر می‌توانند پرهزینه و زمان‌بر باشد. از این رو، اگرچه استفاده از روش سنتی برای توالی یابی DNA در مواردی مفید واقع می‌شود که مولکول DNA طولانی‌تر باشد، اما روش‌‌های توالی یابی با توان بالا به ویژه هنگامی‌ که کل ژنوم‌ نیاز به توالی یابی دارند، مورد استفاده قرار می‌گیرند. در روش‌های توالی یابی با توان بالا سه تفاوت عمده در مقایسه با روش سنگر وجود دارند. اولین تفاوت توسعه یک سیستم عاری از سلول (Cell Free) برای کلون کردن قطعات DNA است. به طور سنتی، قطعه‌ای از DNA که نیاز به توالی یابی داشت، برای اولین بار در پلاسمید پروکاریوتی کلون می‌شد و قبل از استخراج و خالص شدن در باکتری‌ها، همانندسازی و تکثیر می‌شد. توالی یابی توان بالا یا فناوری‌‌های تعیین توالی نسل جدید دیگر از این رویه سخت و زمان‌بر استفاده نمی‌کنند.